Desenvolvimento de uma metodologia semi-automatizada para busca de novas drogas utilizando Leishmania amazonensis fluorescente

As Leishmanioses são doenças negligenciadas. O tratamento dos pacientes é a principal medida de controle, porém a quimioterapia das Leishmanioses apresenta dificuldades incluindo: toxicidade dos medicamentos disponíveis, via de administração parenteral e resistência natural de algumas cepas. O método de teste de drogas clássico in vitro baseado na contgem microscópica de macrófagos infectados apresenta limitações por ser laborioso, não automatizado e sujeito a variações do observador. Deste modo, a busca por novos métodos de triagem de drogas faz-se necessário. O estabelecimento de métodos semi-automatizados contribuiria para aumentar a eficiência da busca de novas drogas contra Leishmania. Neste trabalho, a cepa de Leishmania amazonensis (PH8) foi transfectada com a proteína vermelha fluorescente (RFP). Os parasitos transfectados foram avaliados segundo parâmetros celulares e de susceptibilidade aos fármacos leishmanicidas tradicionais e derivados do propranolol. Os parasitos selvagens (WT) e transfectados (RFP) foram analisados pela Citometria de Fluxo e Microscopia de Fluorescência sendo facilmente discriminados por estas técnicas. Em geral,não foram observadas diferenças na susceptibilidade entre as cepas WT e RFP frente às moléculas testadas.

Os parasitos RFPs foram submetidos ao teste de drogas com posterior leitura no fluorímetro para a padronização do método fluorimétrico. O método fluorimétrico se mostrou bastante reprodutível em relação ao método clássico. Entretanto, durante a padronização do método, mudanças na concentração das drogas foram necessárias bem como a determinação de um ponto de corte nos valores de IC50. Este trabalho também avaliou a atividade leishmanicida dos derivados das poliaminas e complexos metálicos de lapachol utilizando-se o método clássico. Não só os derivados do propranolol, mas também os das poliaminas e lapachol se mostraram tóxicos para células de Hepatoma humano (HepG2). Este trabalho possibilitou pela primeira vez a utilização de parasitos RFPs como modelo de um teste de drogas semi-automatizado

Desenvolvimento de uma metodologia semi-automatizada para busca de novas drogas utilizando Leishmania amazonensis fluorescente / Development of a methodology for semi-automated search for new drugs using fluorescent Leishmania amazonensis

As Leishmanioses são doenças negligenciadas. O tratamento dos pacientes é a principal medida de controle, porém a quimioterapia das Leishmanioses apresenta dificuldades incluindo: toxicidade dos medicamentos disponíveis, via de administração parenteral e resistência natural de algumas cepas. O método de teste de drogas clássico in vitro baseado na contgem microscópica de macrófagos infectados apresenta limitações por ser laborioso, não automatizado e sujeito a variações do observador. Deste modo, a busca por novos métodos de triagem de drogas faz-se necessário. O estabelecimento de métodos semi-automatizados contribuiria para aumentar a eficiência da busca de novas drogas contra Leishmania. Neste trabalho, a cepa de Leishmania amazonensis (PH8) foi transfectada com a proteína vermelha fluorescente (RFP). Os parasitos transfectados foram avaliados segundo parâmetros celulares e de susceptibilidade aos fármacos leishmanicidas tradicionais e derivados do propranolol. Os parasitos selvagens (WT) e transfectados (RFP) foram analisados pela Citometria de Fluxo e Microscopia de Fluorescência sendo facilmente discriminados por estas técnicas. Em geral,não foram observadas diferenças na susceptibilidade entre as cepas WT e RFP frente às moléculas testadas. Os parasitos RFPs foram submetidos ao teste de drogas com posterior leitura no fluorímetro para a padronização do método fluorimétrico. O método fluorimétrico se mostrou bastante reprodutível em relação ao método clássico. Entretanto, durante a padronização do método, mudanças na concentração das drogas foram necessárias bem como a determinação de um ponto de corte nos valores de IC50. Este trabalho também avaliou a atividade leishmanicida dos derivados das poliaminas e complexos metálicos de lapachol utilizando-se o método clássico. Não só os derivados do propranolol, mas também os das poliaminas e lapachol se mostraram tóxicos para células de Hepatoma humano (HepG2). Este trabalho possibilitou pela primeira vez a utilização de parasitos RFPs como modelo de um teste de drogas semi-automatizado.

Desenvolvimento de espécies de Leishmania fluorescentes e caracterização da susceptibilidade de L. amazonensis GFP como modelo para testes quimioterápicos

As Leishmanioses estão entre as doenças tropicais mais importantes classificadas pela Organização Mundial de Saúde como doenças negligenciadas. Seu controle é baseado no tratamento de casos humanos, borrifação com inseticidas e eliminação dos reservatórios quando possível. Entretanto, a quimioterapia das Leishmanioses apresenta algumas dificuldades tais como: toxicidade dos medicamentos disponíveis, via de administração e resistência natural de algumas cepas. O método de teste de drogas tradicional in vitro apresenta limitações por ser laborioso e sujeito a variações individuais do observador. Devido a estes obstáculos a procura de novas drogas e desenvolvimento de métodos faz-se necessária . Por isso é importante o estabelecimento de um método semi-automatizado para teste de drogas em Leishmania. Para que isto seja alcançado utilizou-se de técnicas de biologia molecular como a inserção de um fenótipo no protozoário permitindo sua detecção em um aparelho. Neste trabalho, produzimos cepas de Leishmania expressando a proteína verde fluorescente (“green fluorescent protein”- GFP). Essa proteína foi transfectada nas espécies brasileiras de maior importância médica: L. chagasi, L. braziliensis, L. amazonensis e L guyanensis. Para confirmar a tranfecção, os parasitos selvagens (WT) e transformados (GFPs)foram analisados pela Citometria de Fluxo (FACS) e Microscopia Laser Confocal (LCM)

Para avaliar se a transfecção teve algum impacto na viabilidade celular de L. amazonensis foram realizados alguns ensaios biológicos como a comparação da curva de crescimento e infectividade em macrófagos entre as cepas selvagem e GFP. Posteriormente foi verificada a susceptibilidade à drogas. L. amazonensis foram expostas aos fármacos tradicionais e moléculas teste e os valores de IC50 determinados. Não foram observadas diferenças na susceptibilidade entre as cepas tanto na presença dos fármacos tradicionais (Anfotericina B e Glucantime), como de moléculas teste (derivadas do propranolol). Baseado nos valores de IC50 obtidos com o teste tradicional a transformação da cepa GFP de L. amazonensis não alterou suas características biológicas nem de susceptilibidade aos agentes leishmanicidas tradicionais e moléculas teste. Algumas moléculas derivadas do propranolol mostraram ser promissoras na atividade leishmanicida. Estes resultados dão suporte à utilização da cepa GFP nos testes semi-automatizados utilizando o fluorímetro. Isso possibilitará o teste de um número maior de fármacos/moléculas aumentando a eficiência do método quimioterápico atual

Desenvolvimento de espécies de Leishmania fluorescentes e caracterização da susceptibilidade de L. amazonensis GFP como modelo para testes quimioterápicos / Development of Leishmania species and characterization of fluorescent susceptibility of L. amazonensis GFP as a model for testing chemotherapeutics

As Leishmanioses estão entre as doenças tropicais mais importantes classificadas pela Organização Mundial de Saúde como doenças negligenciadas. Seu controle é baseado no tratamento de casos humanos, borrifação com inseticidas e eliminação dos reservatórios quando possível. Entretanto, a quimioterapia das Leishmanioses apresenta algumas dificuldades tais como: toxicidade dos medicamentos disponíveis, via de administração e resistência natural de algumas cepas. O método de teste de drogas tradicional in vitro apresenta limitações por ser laborioso e sujeito a variações individuais do observador. Devido a estes obstáculos a procura de novas drogas e desenvolvimento de métodos faz-se necessária . Por isso é importante o estabelecimento de um método semi-automatizado para teste de drogas em Leishmania. Para que isto seja alcançado utilizou-se de técnicas de biologia molecular como a inserção de um fenótipo no protozoário permitindo sua detecção em um aparelho. Neste trabalho, produzimos cepas de Leishmania expressando a proteína verde fluorescente (“green fluorescent protein”- GFP). Essa proteína foi transfectada nas espécies brasileiras de maior importância médica: L. chagasi, L. braziliensis, L. amazonensis e L guyanensis. Para confirmar a tranfecção, os parasitos selvagens (WT) e transformados (GFPs)foram analisados pela Citometria de Fluxo (FACS) e Microscopia Laser Confocal (LCM)

Para avaliar se a transfecção teve algum impacto na viabilidade celular de L. amazonensis foram realizados alguns ensaios biológicos como a comparação da curva de crescimento e infectividade em macrófagos entre as cepas selvagem e GFP. Posteriormente foi verificada a susceptibilidade à drogas. L. amazonensis foram expostas aos fármacos tradicionais e moléculas teste e os valores de IC50 determinados. Não foram observadas diferenças na susceptibilidade entre as cepas tanto na presença dos fármacos tradicionais (Anfotericina B e Glucantime), como de moléculas teste (derivadas do propranolol). Baseado nos valores de IC50 obtidos com o teste tradicional a transformação da cepa GFP de L. amazonensis não alterou suas características biológicas nem de susceptilibidade aos agentes leishmanicidas tradicionais e moléculas teste. Algumas moléculas derivadas do propranolol mostraram ser promissoras na atividade leishmanicida. Estes resultados dão suporte à utilização da cepa GFP nos testes semi-automatizados utilizando o fluorímetro. Isso possibilitará o teste de um número maior de fármacos/moléculas aumentando a eficiência do método quimioterápico atual